體外藥代動力學研究

—熱點問題—

第一題    在代謝穩(wěn)定性研究中，需要使用肝微粒體和原代肝細胞兩個試驗系統(tǒng)進行試驗嗎？

肝微粒體是肝組織在勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，包含了CYP450酶和一些二相酶，如UGTs、ST等。原代肝細胞(Primary hepatocytes)是指從動物肝臟直接分離后立即培養(yǎng)的肝細胞，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是較好的保留了與體內(nèi)一致的酶水平。在代謝穩(wěn)定性研究中，不需要考慮成本，可同時選擇兩種試驗系統(tǒng)進行試驗；也可根據(jù)化合物的代謝特性選擇合適的試驗系統(tǒng)，原則是哪個系統(tǒng)代謝速率高選哪個。一般情況下，化合物分子水溶性較強、一相代謝為主要代謝途徑（尤其是經(jīng)由CYP）等情況下，肝微粒體為不錯的選擇；二相代謝為主要途徑、水解作用為主要代謝途徑、肝微粒體中非特異性蛋白結(jié)合很高、肝微粒體中代謝不明顯的時候，可使用原代肝細胞進行試驗。

第二題    代謝穩(wěn)定性試驗中微粒體濃度是考察過的嗎?過高或過低有什么影響呢？

在代謝穩(wěn)定性試驗中，蛋白濃度也會影響代謝速率，通常選擇的微粒體蛋白濃度為0.1mg/mL~1mg/mL，具體選用多大蛋白濃度需根據(jù)化合物自身代謝特性去選擇。微粒體蛋白濃度過高，會導致藥物和微粒體蛋白非特異性的結(jié)合；而微粒體濃度過低，則可能導致藥物的代謝不明顯。

第三題    非特異性蛋白結(jié)合對試驗結(jié)果有什么影響？

如果候選藥物與微粒體蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，則會導致動力學參數(shù)的改變。隨著蛋白濃度的增加，Km值也會增大，從而造成推測的內(nèi)在清除率偏低。同時，候選藥物與微粒體中蛋白的結(jié)合，也會造成不同實驗室和不同體系結(jié)果差異較大。

第四題    藥物只做一相代謝可代謝10%，只做二相代謝也只代謝10%，但使用二相代謝試劑盒卻可代謝50%，如何解釋？

藥物的生物轉(zhuǎn)化，分為一相代謝反應和二相代謝反應。藥物在一相代謝反應中主要發(fā)生氧化、還原和水解的反應，經(jīng)過一相代謝反應，藥物可能帶有一些極性基團，如羥基、羧基等。二相代謝，又稱結(jié)合反應，一相代謝產(chǎn)物或原型藥物在酶的影響下與內(nèi)源性小分子發(fā)生結(jié)合，使藥物毒性、活性降低或極性增加而易于排出的反應。一般來說，藥物先進行一相反應進行轉(zhuǎn)化，如果極性依然較弱，則會啟動二相反應，但有些藥物可直接進行二相反應。所以，才會有以上現(xiàn)象的存在。

第五題    半衰期和清除率怎么計算？

將受試物在0min濃度作為100%，各時間點的受試物濃度與0min濃度相比得到剩余百分數(shù)。各時間點的受試物剩余百分數(shù)的自然對數(shù)與孵育時間經(jīng)線性回歸，求得斜率(k)，由公式求得各種屬微粒體中的消除半衰期t1/2和體外肝微粒體中的固有清除率Clint in vitro。

第六題    原代肝細胞代謝穩(wěn)定性試驗細胞密度推薦多少？清除率計算和肝微粒體一樣的嗎？

原代肝細胞代謝穩(wěn)定性試驗推薦的細胞密度為0.5~2×106個/mL，清除率計算和肝微粒體代謝穩(wěn)定性試驗的結(jié)果處理方法是一致的。

第七題    代謝穩(wěn)定性研究試劑盒中陽性底物的作用是什么？孵育時間點應如何設置？

試劑盒中陽性底物的作用主要是為了證實試劑盒的有效性。孵育時間點的設置主要看是基于什么試驗目的，若只是為了驗證孵育系統(tǒng)是否正常工作，僅需設置0點和一個非零時間點即可；若需考察陽性底物的代謝穩(wěn)定性特征，則需設置0點和3~5個非零時間點。

第八題    肝微粒體試驗中，孵育時是否要開蓋保證有氧氣的參與？

理論上來講，一相代謝反應是有氧反應，需要有氧氣的供應，我們內(nèi)部曾做過驗證，孵育時開不開蓋對結(jié)果沒有影響。

第九題    代謝穩(wěn)定性試驗中必須要有鎂離子嗎？鎂美離子的作用是什么??？

代謝穩(wěn)定性研究可以有肝微粒體和原代肝細胞兩種試驗系統(tǒng)可供選擇。如果使用原代肝細胞為試驗系統(tǒng)不需要添加鎂離子，如果選擇肝微粒為試驗系統(tǒng)則需要添加鎂離子來輔助代謝，鎂離子可以有效的提高酶的活性。

第十題    代謝產(chǎn)物鑒定試驗中孵育時間該如何選擇？

代謝產(chǎn)物鑒定的試驗系統(tǒng)需與代謝穩(wěn)定性試驗保持一致。如果選用肝微粒體為試驗系統(tǒng)，孵育時間通?？刂圃?0min內(nèi)(最長不超過2h)；如果選用肝細胞為試驗系統(tǒng)，孵育時間需控制在120min內(nèi)(最長不超過4h)，在設定的孵育時間內(nèi)調(diào)整肝微粒體的加入量或肝細胞的終濃度，讓藥物的剩余量控制在10%~50%的范圍內(nèi)，以保證有足量的代謝產(chǎn)物生成而便于進行產(chǎn)物推斷。

十一題    代謝穩(wěn)定性藥物濃度一般為1μM，代謝產(chǎn)物鑒定一般10μM，這個濃度如果體內(nèi)遠遠達不到該怎么辦？

在代謝穩(wěn)定性試驗的目的是得到半衰期和體外清除率的數(shù)據(jù)，從而推斷體內(nèi)的清除率。理論上，孵育濃度低至<<Km值時，測得的Clint就基本上不在變化了，而大部分化合物的Km>>1μM，故一般未知化合物都會選1μM進行試驗；代謝產(chǎn)物鑒定試驗提高化合物的濃度的目的是能夠有足量的產(chǎn)物生成而利于產(chǎn)物鑒定。如果體內(nèi)達不到，可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。

十二題    一相代謝和二相代謝所用的緩沖液是不一樣的嗎？PBS和Tris緩沖液？

有文獻報導，對于大多數(shù)UGT酶亞型，由于PBS緩沖液會降低其選擇性和酶活性，所以二相代謝中選用了Tris緩沖液，故導致了一相代謝和二相代謝所使用的緩沖液有差異。

十三題    如果需要同時考察一相和二相代謝，試驗系統(tǒng)應如何選擇？

如果要同時考察一相和二相代謝，選擇原代肝細胞作為試驗系統(tǒng)是不錯的選擇。原代肝細胞具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，不需要額外添加輔助因子，可以很好的模擬體內(nèi)的代謝情況。

十四題    磷酸鹽緩沖液的目的是什么啊？為什么要磷酸根呢？

磷酸鹽緩沖液的目的是模擬生理環(huán)境，磷酸根是維持體內(nèi)體液環(huán)境最重要的緩沖對之一，故選擇了磷酸根。

十五題    0min代謝點總是會發(fā)生代謝反應，該如何處理？

建議先加入終止液，再啟動代謝反應。